22、利用共聚焦和电子显微镜可视化突触连接

利用共聚焦和电子显微镜可视化突触连接

1. 组织制备

在大多数相关工作中，使用游离切片进行免疫组织化学实验。通常选取腰部脊髓组织块，用振动刀片切片机（如 Leica 的 VT1200 或 VT1000S）切成 60μm 厚的切片。之后，将切片置于 50%酒精中孵育 30 分钟，使组织通透，便于后续抗体孵育。

若切片要进行用于电子显微镜的免疫过氧化物酶标记，则需额外进行两步处理：先在含 0.3% H₂O₂ 的 PB 中孵育 30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性；再在含 1%硼氢化钠（NaBH₄）的 PB 中孵育 30 分钟，以淬灭游离醛基。每步之间，切片都要在 PB 中充分冲洗（用 NaBH₄ 孵育后需冲洗 9×10 分钟，其他阶段冲洗 3×10 分钟）。由于 NaBH₄ 溶液会剧烈冒泡，此阶段要打开盖子。

此时，组织可用于以下几种情况：
1. 共聚焦显微镜的免疫组织化学；
2. 电子显微镜的预包埋免疫组织化学；
3. 相关共聚焦和电子显微镜的免疫组织化学；
4. 常规树脂包埋；
5. 冷冻置换树脂包埋。

多余的切片可储存在 -20°C 的甘油中，以备将来使用。

1.1 操作步骤总结

步骤	操作	时间
切片	用振动刀片切片机将组织切成 60μm 厚切片	-
酒精孵