5mC RIP-报告（RNA甲基化m5C)

一、实验目的：

利用5mC抗体结合并沉淀具有5mC修饰的RNA片段；qPCR检测验证目标基因5mC修饰情况及具体位点。

二、实验材料

    主要试剂

   

试剂名称	厂家	货号
PMSF	Genstar	B111-01
磷酸酶抑制剂	Selleck	B15001
蛋白酶抑制剂	Selleck	B14001
反转录试剂盒	TAKARA	RR037A
Anti-5-methylcytosine (5-mC) 抗体	ABCAM	ab10805
Murine RNase Inhibitor(40 U/µL) 鼠源RNase抑制剂	Yeasen	10603ES05
RNA甲基化免疫共沉淀试剂盒(Merip KIT)	Bio.ruqi	RQM008
qPCRmix	Yeasen	11202ES03

主要仪器及器材

仪器名称	厂家	货号
高速冷冻离心机	湘仪	TGL-16
PCR仪	BIO-RAD	PTC-100
DynaMag™-2 磁力架	Thermo	12321D
荧光定量qpcr仪	Thermo Fisher Scientific	ViiA7
垂直混匀器	Kylin-Bell	BE-1100

三、蛋白与RNA信息 

抗体信息：

Anti-5-methylcytosine (5-mC) 抗体   

四、实验步骤

（一）RNA提取

1. 样本前处理：收集 1×10^7细胞后，用预冷的 1×PBS漂洗两次，1000 rpm 室温离心 5 min，去上清；
2. 向细胞中加入 1 mL Trizol 裂解，吹打至完全看不到细胞团块，室温放置 5 min；
3. 按 1 mL Trizol 加入 200 μL 氯仿，盖好管盖（注意：此次一定要盖好盖子，避免震荡过程中液体渗出）。用手剧烈震荡 15 s，室温放置 3 min；
4. 12000 g、4℃离心 15 min；
5. 小心转移上清液（约500 μL）至新的 1.5 mL 无酶离心管中；
6. 加入等体积异丙醇，室温静置10min；（若预期RNA量比较少，可加入适量糖原，并于-20℃或-80℃沉淀过夜；）
7. 12000 g、4℃离心 10 min；弃掉上清，保留沉淀；
8. 加入 1 mL 75％乙醇，颠倒混匀；
9. 7500 g、4℃离心 5 min；弃掉上清；
10. 7500 g、4℃离心 30s，用10ul小枪头尽量吸掉残留的液体；
11. 室温静置5~10min，晾干乙醇；（看到RNA变半透明即可）
12. 加入适量RNase-free水溶解RNA,室温静置10min，令RNA可以充分溶解；
13. RNA冻存到-80℃冰箱备用。

（二）RNA片段化

1.  RNA 样品中加入 等体积的frag buffer,吹打混匀；

2.  94℃孵育6min；

3.  用酚氯仿回收RNA;

4.  配制 1%琼脂糖凝胶检测 RNA 片段大小；

5.  取2 μL RNA 样品作为 Input 样品-80℃保存备用；

6.  取分别取 20 μL RNA 样品作为m6A组及IGG组。

（三）免疫沉淀

1.  5mC组及IgG组分别中加入 4μg 5mC 抗体及IgG抗体，置于垂直混匀器 4℃孵育过夜（16h）。

(五)  protein A/G 与抗体结合

1.  取出protein A/G 磁珠，并充分震荡混匀；m6A组及IgG组中分别加入20ul磁珠，垂直混匀器 4℃孵育2 h；

2.  把样本置于磁力架上，静置1min，吸除上清；

3.  向EP管中加入200ul洗涤缓冲液，轻轻吹打混匀；并于垂直混匀器 4℃洗涤 5 min；

4.  把样本置于磁力架上，静置1min，吸除上清；

5.  重复3与4步骤3次。

(六)  RNA纯化回收

1.  input、m6A、IgG样本分别1 mL Trizol 裂解液；

2.  吹打混匀并置于垂直混匀器4℃裂解15min；

3.  按照（一）步骤，纯化回收RNA;

(六)  RNA 反转录

1.  按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。

试剂组分	使用量	终浓度
5×PrimeScript Buffer（for Real Time）	2uL	1×
PrimeScript RT Enzyme Mix I	0.5uL
Random 6 mers（100 μM）*1	0.5uL	50 pmol
RNA	7 uL

注意：注意反转录步骤RNA投入量按等体积进行，后续实验稀释及上机检测皆按比例进行。

2.  按如下程序进行反转录：

37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！

3． 定量PCR检测

1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2） 冰上配制下表中的反应液

成分	加入量	终浓度
Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (low Rox)	5μL	1×
Forward Primer (10μM)	0.2μL	0.2 μM
Reverse Primer (10μM)	0.2μL	0.2 μM
cDNA	2μL
RNase-free Water	to 10μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数	步骤	温度	时间	荧光采集
1	预变性	95℃	5min	No
40	变性	95℃	10s	No
	退火	60℃	30s	Yes
上述反应结束后，从60℃～95℃过程中进行熔解曲线分析

5．实验结果

qPCR检测结果(详细数据见附件excel” 5mC RIP分析结果”)

5mC RIP-qPCR柱状图:

RNA 片段化图：