【生物化学笔记：药品药物】Moderna的《mRNAs as Medicines》课程第二章：小分子&蛋白质药物历史 + mRNA制造的优势与挑战 + 载体系统&脂质纳米颗粒（LNP）技术

• Moderna的《mRNAs as Medicines》课程共三章，面向所有人，无论您当前的科学知识水平如何。课程旨在为您提供对mRNA药物的全面理解，包括其工作原理及其潜在应用，视频地址。

小分子与蛋白质药物：传统医药的基石

模块概述

• 学习了蛋白质和mRNA的结构、合成方式及其在体内的作用。本模块将探讨：
  • 经典药物的特性
  • 技术进步如何扩展了药物选择
  • 重新思考药物的可能性
• 核心问题：蛋白质和mRNA如何作为药物使用？

药物的定义

法律定义

药物（或称药品、药物制剂）是指：

“旨在用于疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防的物质”

小分子药物

1. 常见形式

• 日常服用的药片
• 活性成分通常为小分子

2. 物理特性

• 尺寸：远小于蛋白质或mRNA
• 尺度：相当于单个氨基酸或核苷酸构件
• 穿透能力：许多小分子能轻松穿过细胞膜，在体内发挥作用而无需特殊递送系统

3. 主要优势

1. 稳定性：
   • 多数可制成固体剂型
   • 在室温下长期稳定
2. 给药便利性：
   • 多数可口服
   • 经消化系统溶解后可分布到全身（有时包括大脑）

4. 常见类型

• 抗生素：如青霉素
• 止痛药：如布洛芬、乙酰水杨酸（阿司匹林）
• 其他广泛用途：
  • 治疗花粉症、恶心
  • 降血压、降胆固醇药物
  • 精神疾病治疗药物（如抑郁症、精神分裂症）

5. 局限性

• 研发过程复杂：
  • 初期需筛选数万种化合物
  • 需要数年的药物化学优化，将初步"命中"化合物改造为有效药物
• 靶点限制：主要针对细胞表面或细胞内的特定分子靶点

核心要点：小分子药物因其稳定性、口服便利性和组织穿透能力，已成为最常用的药物形式。然而其研发周期长、筛选难度大，且对某些疾病靶点难以发挥作用，这促使了新型药物形式的发展。

蛋白质药物：治疗性生物制剂与疫苗

小分子药物的作用机制

• 核心原理：与特定蛋白质结合并改变其功能
• 作用方式：
  • 抑制型：减慢或完全抑制靶蛋白功能
  • 激活型：增强靶蛋白功能
• 通用策略：通过调节蛋白质活性来治疗疾病
  

小分子药物的研发挑战

1. 复杂的研发流程

• 优化阶段：初步筛选后需经过数年药物化学改造
• 验证阶段：还需数年的临床前和临床研究来证明安全性和有效性

2. 高失败率

• 大多数小分子在研发过程中因以下原因被淘汰：
  • 意外的毒性
  • 缺乏疗效

3. 成本与时间

• 由于需要筛选大量化合物且失败率高
• 小分子药物开发既耗时又昂贵

---

蛋白质作为药物

1. 治疗性蛋白质（蛋白生物制剂）

• 已成为重要的药物类别
• 作用位置：绝大多数在血液中发挥作用

2. 主要类型与应用

• 胰岛素：治疗糖尿病
• 凝血因子：治疗血友病
• 促红细胞生成素：治疗贫血
• 单克隆抗体：
  • 应用广泛：从抗病毒感染到癌症、关节炎治疗
  • 批准速度：2015-2020年间，FDA每年批准约10种新单克隆抗体药物

3. 蛋白质亚单位疫苗

• 来源：病毒或细菌的特定蛋白质
• 用途：预防未来感染
• 安全性优势：
  • 仅包含病原体的一小部分
  • 不可能引起疾病
• 作用机制：预先激活免疫系统，使其能识别并应对特定病原体

蛋白质药物的局限性

尽管具有显著优势，蛋白质药物也存在明显限制

蛋白质药物的局限性与mRNA药物的机遇

历史教训：早期蛋白质药物的风险

1. 胰岛素的问题

• 早期来源：从动物体内纯化
• 主要缺陷：
  • 氨基酸序列与人类胰岛素略有不同
  • 容易引起患者过敏反应
    

2. 血友病治疗的悲剧

• 早期治疗：使用从捐赠人血中纯化的凝血因子
• 严重后果：
  • 1960年代：数千名患者感染乙肝
  • 1980年代：数千名患者感染艾滋病
• 改进时间点：
  • 1969年实施乙肝筛查
  • 1985年实施HIV筛查

现代生产方法

1. 重组技术

• 当前主流：大多数治疗性蛋白质使用基因工程改造的哺乳动物细胞系生产
• 术语：“重组”（recombinant），意为"新的组合"

2. 生产过程

• 培养设备：大型不锈钢生物反应器
• 基础设施要求：
  • 需要重大工业设施
  • 维持细胞存活
  • 防止污染
• 成本：非常昂贵

蛋白质药物的技术挑战

1. 稳定性与配方

• 每种治疗性蛋白质都是独特的
• 需要大量工作来确定最佳的稳定和配方方案
• 目标：
  • 防止储存期间降解
  • 确保注射后能按预期功能发挥作用

2. 递送限制

• 大多数蛋白质难以进入细胞
• 作用范围受限：
  • 主要在细胞外（如血液中）
  • 或在内吞体、溶酶体等特殊细胞区室中

3. 靶点局限性

• 超过90%的人类蛋白质位于：
  • 细胞内部
  • 细胞膜上
• 这意味着传统蛋白质药物无法有效靶向这些重要位置的蛋白质

mRNA药物的创新思路

核心理念

• 传统方式：向人体提供预先制造的蛋白质
• mRNA方式：仅提供制造蛋白质的指令（即mRNA）

优势

通过在细胞内生产蛋白质，mRNA技术使任何类型的蛋白质都可能成为药物：

• 细胞内蛋白
• 膜结合蛋白
• 分泌蛋白

这突破了传统蛋白质药物只能作用于细胞外环境的限制。

实现难度

• 理论看似简单，实则复杂
• mRNA作为药物的能力是近年才实现的
• 依赖于学术界和产业界研究人员数十年的努力
• 后续课程将探讨开发mRNA药物需要克服的多重障碍

---

理想药物的三大特性

理想的药物应具备：

1. 剂量依赖性：效果随剂量变化
2. 时效限制性：作用时间有限
3. 可重复给药：可多次使用

传统小分子和蛋白质药物都具备这三种特性。时效限制性尤为重要——若出现副作用，停药即可。

mRNA的内在特性分析

1. 固有的瞬时性

• 与DNA对比：DNA是遗传信息的永久存储库
• 蛋白质和mRNA：本质上都是短暂存在的
  • 大多数蛋白质处于持续更新状态
  • 具有有限的生命周期，需要定期补充
  • 编码它们的mRNA也不断被制造和降解

2. 生物学意义

这种动态平衡使身体能够：

• 快速改变关键蛋白质的数量
• 及时响应环境变化

案例研究：昼夜节律钟

• 核心组件：“时钟蛋白”（clock proteins）
• 周期规律：每24小时精确地出现和消失
• 调控方式：通过每日循环的时钟mRNA生成与降解来实现

• 蛋白质产量与同时存在的mRNA量紧密相关
• 每天重复这一过程，为身体提供"日常剂量"的时钟mRNA

半衰期的概念

• 定义：半衰期是指某种物质生成后，其一半数量消失所需的时间
• 用途：衡量蛋白质和mRNA在细胞内存在时间的常用指标

蛋白质半衰期的多样性

1. 长寿命蛋白质

• 结构蛋白：通常寿命最长
  • 晶状体蛋白（Crystalline）：
    • 眼睛晶状体中的蛋白
    • 半衰期超过70年
    • 一旦形成便不可替换，需维持终生
• 抗体：
  • 半衰期10-21天
  • 属于较长寿命的蛋白质
• 巨肌蛋白（Titin）：
  • 尽管是巨大蛋白质
  • 半衰期仅3天

2. 中等寿命蛋白质

• 代谢酶类：
  • 如葡萄糖-6-磷酸酶（Van Gerke病中缺失的蛋白）
  • 半衰期8-48小时

3. 短寿命蛋白质

• 信号蛋白：
  • 如松弛素（relaxin）激素
  • 半衰期<10分钟

4. 总体分布

• 蛋白质半衰期跨度极大：从几分钟到数十年
• 中位数：约30小时（略超过一天）

mRNA的半衰期特征

1. 总体特性

• mRNA的寿命远不如蛋白质长
• 典型人类mRNA：半衰期仅5小时

2. 变异范围

• 最短：仅几分钟
• 最长：约5天
• 整体覆盖一个广泛的动态范围

mRNA作为药物的理想特性

mRNA的天然药物属性

1. 固有的瞬时性

• 关键事实：没有mRNA会持续终生
• 设计原理：短暂存在是为了让身体能够按需制造适量的蛋白质

2. 三大经典药物特性

mRNA天然具备理想药物的全部三个基本属性：

1. 瞬时性：效果不会永久持续
2. 剂量依赖性：mRNA剂量与编码蛋白产量呈正相关
3. 可重复诱导：可多次给药，反复产生蛋白质

这使mRNA成为符合理想药物标准的完美候选者。

---

mRNA药物的额外优势

1. 全能蛋白生产平台

• 能指导身体制造任何类型的蛋白质
• 不仅限于细胞外作用的蛋白
• 可靶向细胞内、膜结合和分泌蛋白

2. 微型化生产基础设施

• 对比传统蛋白药物：
  • 重组蛋白需要大型生物反应器和哺乳动物细胞培养
  • mRNA生产无需细胞培养系统
• 生产方式：完全基于化学、生物化学和生物物理过程
• 设备特点：
  • 设备相对小型化
  • 可移动
  • 生产设施高度灵活适应

3. 生产成本与规模优势

• 所需基础设施和设备相对简单
• 制造成本显著降低
• 易于扩大或缩小生产规模

治疗潜力广泛

mRNA技术有望满足多种未被满足的医疗需求，包括：

• 快速疫苗开发：针对新出现的病原体迅速开发疫苗
• 癌症免疫治疗：激活免疫系统对抗癌症
• 遗传代谢病治疗：恢复患者制造缺失蛋白质的能力

全球化生产网络

1. 分布式制造

• mRNA药物生产设施可轻松在世界各地多个地点建立
• 关键优势：实现本地化生产和快速分发

2. 数字化传输

• mRNA本质上是核苷酸序列信息
• 一旦成功开发新mRNA药物（如针对新发传染病的疫苗）：
  • mRNA序列可通过数字方式即时发送到所有生产基地
  • 实现全球同步的本地合成和分发

3. 未来微型化

• 随着技术进步
• 可能将整个生产过程缩小到单个台式设备中完成

mRNA作为信息分子的独特性

核心特征

• 非直接活性药物：mRNA本身不是治疗物质
• 角色定位：是指导身体制造治疗性蛋白质的"配方"

平台化优势

当药物开发者掌握了：

1. 临床级mRNA的生产和制剂技术
2. 将mRNA靶向递送到特定细胞类型的方法（如：
   • 疫苗：免疫细胞
   • 代谢疾病治疗：肝细胞）

即可通过简单替换mRNA序列来创建新型药物，例如：

• 从一种疫苗快速转换到另一种疫苗
• 从一种治疗药物转换到另一种治疗药物

mRNA：真正的平台技术

1. 平台定义

根据Techopedia.com，平台是：

“一组作为基础的技术，用于开发其他应用、流程或技术”

2. 类比智能手机

• 我们身边的平台：智能手机
  • 手机硬件 + 操作系统 = 平台
  • 平台支持无数应用程序的快速开发

3. mRNA药物平台构成

• 硬件：mRNA药物生产设备
• 操作系统：不同规模下生产mRNA药物的工艺和技术诀窍
• 核心优势：
  • 同一类型的mRNA药物使用相同的原材料和生产工艺
  • 新药开发几乎无需重新设计
  • 极大加速"应用程序"（即具体mRNA药物）的开发时间线

多重化优势

• mRNA药物可轻松实现多重化（multiplexing）
• 单次给药可同时递送多种mRNA
• 为联合治疗和多价疫苗提供了可能

多重化治疗潜力

1. 同时递送多种mRNA

• 单次给药可同时递送多种mRNA分子
• 为身体提供指令，使其同时制造多种不同蛋白质

2. 应用场景

• 多蛋白复合物：
  • 某些蛋白质以多蛋白复合物形式发挥作用
  • 可同时递送编码复合物各组分的mRNA
  • 实现完整复合物的体内合成
• 联合疫苗：
  • 将编码不同病原体蛋白的mRNA疫苗组合
  • 单次注射即可预防多种传染病

这一特性极大地扩展了mRNA药物的治疗范围和效率。

mRNA药物的技术挑战与体外生产

核心原理回顾

• mRNA药物通过利用人体自然的蛋白质生产过程
• 使人体能够自行制造治疗性蛋白质

首要挑战：体外mRNA生产

1. 自然过程 vs. 工业需求

• 体内过程：在细胞核内从DNA转录产生mRNA
• 工业需求：需要在细胞外（体外）大量生产mRNA

2. DNA模板的制备

1. 载体构建：将特殊修饰的DNA片段插入细菌
2. 扩增复制：利用细菌繁殖产生大量DNA拷贝
3. 纯化分离：仔细分离并纯化扩增后的DNA

3. mRNA合成过程（纯生化反应）

1. 线性化：用特殊的"分子剪刀"切割DNA模板，使其线性化
2. 体外转录：
   • 将线性DNA与核苷酸混合
   • 加入特殊的T7 RNA聚合酶
   • 聚合酶按正确顺序连接核苷酸，生成mRNA
     

关键特点：此过程完全无细胞（cell-free），仅依赖生化反应，为后续大规模生产奠定了基础。

• 灵活的生产规模，mRNA合成反应可在多种规模进行：

  • 研究级：微量用于实验室研究
  • 个体化医疗：单个患者的用量
  • 罕见病治疗：数十至数百名患者的用量
  • 大规模疫苗生产：单批次可生产数千万剂mRNA疫苗
    

• 质量控制，纯化后的mRNA需经过多重质控步骤，确保：

  • 完全去除DNA残留
  • 去除所有未反应原料
  • mRNA分子完整性达标

---

mRNA递送挑战

1. 无法单独给药

mRNA不能直接作为药物使用，因为人体存在多重生物屏障：

2. 给药途径限制

• 口服不可行：会被视为食物立即分解
• 主要给药方式：
  • 疫苗：肌肉注射
  • 治疗药物：静脉注射（IV）
• 新兴途径：
  • 鼻腔/肺部吸入（通过吸入器）
  • 皮肤直接应用

3. 生物稳定性问题

• 体内环境：mRNA通常不存在于细胞外
• 免疫识别：血液或淋巴系统中的裸露mRNA会被识别为：
  • 死亡细胞碎片
  • RNA病毒感染证据
• 快速降解：体液中的"清洁"蛋白会迅速破坏裸露RNA

4. 靶向性缺失

• 无导航系统：mRNA分子本身不含靶向特定组织或细胞的信号
• 无法跨越细胞膜：
  • mRNA带高度负电荷，难以穿过细胞膜

递送解决方案：载体系统

由于上述所有原因，mRNA药物需要递送载体——一种包装材料，必须实现三个关键功能：

1. 保护：防止mRNA在到达目标前被降解
2. 靶向：帮助mRNA找到并进入目标细胞
3. 穿透：协助mRNA跨越细胞膜进入细胞质

脂质纳米颗粒（LNP）作为主要递送系统

• 尽管多种递送载体正在测试中 最常用的是脂质纳米颗粒（LNPs）

LNP的结构与组成

1. 核心结构

• 内部：包裹着mRNA货物
• 外部：由脂质（脂肪）构成
  • 脂质是构成所有细胞膜的基本成分
  • 具有疏水性（不溶于水）
  • 自然形成脂质双层或球形结构
• 本质：极微小的"脂肪球"

2. 关键挑战：如何将mRNA包裹在脂肪球内？

• 问题根源：mRNA因其磷酸骨架带有高度负电荷
• 传统方案缺陷：
  • 使用永久带正电荷的脂质可吸引mRNA
  • 但这类脂质对身体耐受性差

3. 创新解决方案：可电离脂质

• 设计原理：
  • 在酸性条件下带正电荷
  • 在生理pH值（接近中性）下变为不带电
• 工作过程：
  1. 酸性环境下：带正电的可电离脂质包裹带负电的mRNA
  2. 进入体内后：转变为中性，减少毒性
• 优势：既保证包装效率，又提高生物相容性

4. 增强稳定性结构

• 问题：可电离脂质与mRNA的结合不够稳定
• 解决方案：添加额外保护层
  • 成分：
    • 双层磷脂（phospholipid）
    • 间杂胆固醇
  • 生物学意义：
    • 磷脂双层和胆固醇都是人体细胞膜的重要组成部分
    • 提高LNP的稳定性和生物相容性

结构验证

• 冷冻电镜图像清晰显示：
  • 深色核心：包含mRNA和可电离脂质
  • 外围结构：包围核心的脂质双层膜

LNP的基本参数

1. 载体容量

• 每个LNP包含4-6个mRNA分子

2. 尺寸要求

• 理想直径：80-100纳米
  • 约为人发宽度的1/1000
• 数量级：每剂mRNA疫苗包含数万亿个LNP
• 尺寸重要性：特定尺寸范围有利于细胞高效吸收

---

稳定性保护机制

1. 融合问题

• LNP是软性材料
• 储存时若相互接触会融合，形成越来越大的"脂肪球"

2. 防融合解决方案：表面活性剂

• 功能：防止LNP在储存期间相互融合
• 常用物质：聚乙二醇（PEG）
  • 广泛用于FDA批准的药物
  • 存在于化妆品、牙膏等非处方产品中
• 作用机制：
  • PEG涂层在LNP碰撞时保持脂质双层分离
  • 有效防止融合

体内靶向机制

1. 生物识别

• 类比：HDL和LDL（脂质转运复合物）
  • 在血液中运输脂肪
• 相似性：LNP在人体看来非常类似于天然脂质转运复合物

2. 靶向工程

• 不同脂质转运复合物对特定组织/细胞有亲和力
• LNP可被设计成具有特定组织/细胞亲和力
  

细胞内递送过程

1. 细胞摄取

• 机制：内吞作用（endocytosis）
• 过程：
  1. 细胞膜包裹LNP
  2. 向内凹陷形成膜结合区室——内吞体（endosome）
     

2. 最终释放

• 关键步骤：LNP与内吞体膜融合
• 结果：将mRNA释放到细胞质
• 后续：mRNA与核糖体结合并翻译成蛋白质

LNP成分的生物降解

1. 磷脂和胆固醇

• 来源：是人体细胞膜的正常组成部分
• 代谢方式：像体内其他脂质一样被正常代谢
• 安全性：
  • mRNA药物中的胆固醇含量极微小
  • 相比人体内固有胆固醇量可忽略不计
  • 对整体胆固醇水平无影响

2. 可电离脂质和PEG

• 设计特点：被工程化设计为可降解
• 降解过程：
  • 分解成更小的片段
  • 通过正常代谢途径快速清除
• 清除时间：所有片段在几天内完全消除

这确保了LNP载体系统的生物相容性和安全性。

---

克服先天性免疫屏障

回顾：LNP的作用

• 脂质纳米颗粒（LNP）保护mRNA免于过早降解
• 并将mRNA有效递送到细胞内

最后重大障碍：先天性免疫系统

1. 免疫系统认知误区

• 提到"免疫系统"，人们通常想到抗体
  • 抗体是血液中识别和中和特定病原体的蛋白质
  • 由B细胞产生

2. 适应性免疫系统

• 组成：
  • B细胞：产生抗体
  • T细胞：另一关键细胞类型
    • 细胞毒性T细胞：识别并清除体内感染或异常细胞
• 疫苗作用机制：利用适应性免疫系统提供针对特定病原体（如SARS-CoV-2）的保护

先天性免疫系统（非特异性免疫）：mRNA药物的主要障碍

适应性免疫系统的局限性

1. 功能特点

• B细胞：产生抗体，中和特定病原体
• T细胞：
  • 细胞毒性T细胞识别并清除被病原体感染的细胞
  • 防止感染细胞产生更多病原体

2. 响应速度限制

• 初次响应：需要数周至数月建立新的适应性免疫反应
• 再次响应：需要数天时间重新激活对既往接触过病原体的免疫
• 结论：对于新出现的病原体，适应性免疫系统响应太慢，不适合作为第一道防线

---

先天性免疫系统

1. 核心功能

• 作为抵御新病原体的第一道防线
• 不识别特定病原体的独特特征
• 识别特定类型病原体的共有特征

2. 识别机制示例

• 细菌识别：
  • 许多细菌表面含有脂多糖（LPS）
  • 先天性免疫系统持续监测体内LPS
  • LPS是细菌入侵的早期预警信号
• 免疫反应：
  • 识别LPS后触发炎症警报
  • 导致身体疼痛和发烧等症状

病毒RNA的先天性识别

1. RNA病毒特征

• 许多人类病毒以RNA形式携带遗传指令
• 常见例子：冠状病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒

2. 感染过程与免疫监视

• 进入细胞：通过内吞作用
• RNA释放：从内吞体释放到细胞质
• 不完全效率：部分病毒RNA会滞留在内吞体内

3. 免疫识别原理

• 正常情况：人体自身mRNA在细胞核产生，存在于细胞质，不会出现在内吞体内
• 异常信号：内吞体内的RNA被视为危险信号
• 防御机制：先天性免疫系统有特殊蛋白质传感器，持续监测内吞体内的RNA

克服先天性免疫屏障：mRNA药物的关键突破

内吞体中的RNA识别机制

1. 危险信号识别

• 当传感器检测到内吞体内的RNA时，会假定其具有危险性
• 免疫反应：
  • 触发警报信号
  • 释放干扰素和细胞因子
  • 导致局部炎症和可能的发烧

LNP递送面临的免疫挑战

1. 类似病毒的递送路径

• LNP通过内吞作用将mRNA递送到细胞（与病毒相同）
• mRNA从内吞体释放到细胞质的效率并非100%
• 部分mRNA会滞留在内吞体内

2. 免疫系统误判

• 含有mRNA的LNP可能被先天性免疫系统视为潜在的RNA病毒
• 关键问题：必须学会如何"绕过"内吞体中的先天性免疫传感器

---

突破策略一：规避单链RNA传感器

1. 关键发现

• 2000年代初的研究表明：
  • 某些传感器识别的分子特征是RNA核苷酸尿嘧啶（U）
  • U结合后会激活传感器，发出危险信号

2. 解决方案

• 使用修饰版的U核苷酸
• 前提：不能干扰核糖体的翻译过程
• 效果：防止传感器在内吞体中识别RNA

3. 自然界的启示

• 尽管A、C、G、U是最常见的RNA核苷酸
• 细胞中存在许多修饰版本
• 自然界已知存在超过100种不同的修饰核苷酸

4. 成功案例

• 1-甲基假尿苷（1-mΨ）：
  • 人体内自然存在的修饰核苷酸
  • 在转录反应中用1-mΨ替代U
  • T7 RNA聚合酶会产生全程含1-mΨ的mRNA
• 效果：这种修饰mRNA能够逃避识别病毒RNA的先天性免疫传感器

突破策略二：规避双链RNA传感器

• 存在另一套防御系统，专门监测长段双链RNA
• 与前述传感器一样，这套系统也是为抵御病毒而进化
• 所有RNA病毒复制时都会经历双链RNA阶段
• 人体自身的mRNA主要是单链结构
• 双链RNA在正常细胞中不存在

---

第二道先天性免疫防线

1. 监测系统

• 另一组先天性免疫传感器同时巡逻：
  • 内吞体
  • 细胞质
• 监测目标：长段完全碱基配对的双链RNA

2. 免疫反应

• 传感器激活后触发警报信号
• 导致干扰素和细胞因子释放
• 引发炎症反应

生产过程中的挑战

• 意外副产物:使用T7 RNA聚合酶转录mRNA的传统工艺会产生少量双链RNA副产物

• 为制造有效的mRNA药物，必须将双链RNA副产物降至最低：

1. 优化转录条件：改变反应参数
2. 严格纯化：实施高效的纯化协议