告别传统免疫：多肽文库筛选如何让CAR-T研发“快人一步”？

在CAR-T疗法研发中，靶点识别是核心挑战。多肽文库筛选技术通过高通量筛选，能快速获得高特异性结合肽，极大加速新型CAR靶向结构域的发现与优化，从而推动更精准、高效的CAR-T疗法开发。

一．CAR-T疗法背景介绍

发表于《Science》的论文《Design of high-specificity binders for peptide–MHC-I complexes》是由诺贝尔奖得主David Baker团队完成，这项研究利用深度学习工具，成功从头设计了能高特异性结合肽-MHC-I类复合物（pMHC）的小蛋白，为癌症和病毒性疾病的精准免疫治疗开辟了新路径。

MHC-I类复合物是一类T细胞表面受体（TCR），它可以有效激活T细胞使其分泌穿孔素或颗粒酶进行细胞杀伤。CAR-T疗法同样是利用T细胞的杀伤作用对癌细胞实现定点消除，具体做法是通过收集患者的外周T淋巴细胞，并对T淋巴细胞进行改造，使嵌合抗原受体（CAR）在T细胞表面表达，将改造后的T细胞重新输入到患者体内。由于CAR可以特异性识别癌细胞表面抗原，所以在CAR的带动下，改造后的T细胞可以对癌细胞进行靶向杀伤。

图1  CAR-T疗法的过程（文献[1]）

图2  CAR-T的结构（文献[1]）

二、多肽筛选

常规CAR序列可以通过免疫癌细胞表面的特异性抗原，然后经抗体文库构建和筛选来得到，耗费的时间较长。多肽筛选的方式可以省去免疫动物的流程，从随机多肽文库中进行直接筛选，筛选到亲和力较好的多肽序列，将筛选到的多肽序列作为CAR序列对T细胞进行改造得到更多候选的治疗性T细胞。我们备有多种即用型肽库试剂盒（如随机7肽、12肽、环7肽库）及M13/T7噬菌体文库定制试剂盒，可以帮助客户快速开展蛋白配体、酶底物及高特异性抗体发现工作，为您的创新研发提供坚实基石。

‍三、多肽文库筛选过程

1.随机肽库构建：基于噬菌体展示技术，将包含随机序列的多肽片段插入噬菌体基因组的特定外壳蛋白基因中，例如构建M13噬菌体则需要插入到pIII或pVIII蛋白基因中。这样，每个噬菌体颗粒表面都会展示一种随机的多肽，而该多肽的编码信息则存在于噬菌体内部，实现了 "表型"与"基因型"的关联。

2.亲和筛选：基于噬菌体展示筛选技术，从庞大的文库中挑选出能与靶标结合的噬菌体。具体操作如下：

吸附：将靶标固定于支持物（如酶标板、磁珠），然后加入噬菌体展示肽库进行孵育。

洗脱：用特定的洗脱液将特异性结合的噬菌体从靶标上洗脱下来（如使用低pH的甘氨酸-盐酸溶液）。

扩增：将洗脱下来结合靶标的噬菌体感染大肠杆菌（TG1）进行扩增及收获，并对洗脱产物及扩增产物进行滴度检测。

3.重复筛选：通常需要经过3到5轮这样的"吸附-洗脱-扩增"过程，才能逐步富集到亲和力越来越高、特异性越来越强的噬菌体克隆。

4.鉴定与分析：筛选完成后，需要对末次筛选洗脱下来的噬菌体进行鉴定分析：

结合验证：在菌平板上挑取单个菌落，将单菌落进行扩增破碎得到噬菌体，通过噬菌体ELISA等方法验证单个噬菌体克隆与靶标的结合情况。

单克隆测序：将ELISA检测结果好的克隆进行一代测序，将测得的序列进行分析，得到目标多肽的序列。

亲和力分析：有时会进一步分析阳性克隆的结合亲和性，这时则可以体外合成多肽，根据靶标的类型及样品的质量可以选择不同的亲和力鉴定的方式。

图3  噬菌体文库筛选过程（文献[2]）

四、结语

卡梅德生物在多肽文库构建服务及筛选上深耕不辍，除了随机7肽、12肽、环7肽库及M13/T7噬菌体文库等现有的多肽文库，我们会根据客户的不同实验需求提供个性化多肽文库定制及筛选服务，在下游多肽的应用方面我们也在不断摸索，创造更多可能。

引用文献

[1] Chen R, Chen L, Wang C, Zhu H, Gu L, Li Y, Xiong X, Chen G, Jian Z. CAR-T treatment for cancer: prospects and challenges. Front Oncol. 2023 Dec 5;13:1288383.

[2] Sawada T, Oyama R, Tanaka M, Serizawa T. Discovery of Surfactant-Like Peptides from a Phage-Displayed Peptide Library. Viruses. 2020 Dec 15;12(12):1442.

[3] Ryvkin A, Ashkenazy H, Weiss-Ottolenghi Y, Piller C, Pupko T, Gershoni JM. Phage display peptide libraries: deviations from randomness and correctives. Nucleic Acids Res. 2018 May 18;46(9):e52.