技术解析 | 从单克隆到单链抗体：PRV gE蛋白特异性scFv的构建、表达与应用前景

原创于 2025-12-02 17:16:58 发布 · 159 阅读

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在动物疫病诊断与防控领域，抗体试剂的革新是推动检测技术发展的核心动力。近年来，随着猪伪狂犬病病毒变异株的持续流行，针对其关键抗原的高质量、低成本检测抗体需求日益迫切。本文基于近期发表于《畜牧兽医学报》的一项研究，结合国内外的相关文献，深入解析针对PRV gE蛋白的单链抗体的制备流程、技术优势及其在诊断应用中的潜力。

一、研究背景：PRV变异株流行与诊断挑战
自2011年以来，我国多地出现猪伪狂犬病病毒变异毒株的暴发与流行。根据多篇流行病学调查报告显示，这些变异株具有传播速度快、毒力增强、与经典株存在抗原性差异等特点，给基于血清学的鉴别诊断带来巨大压力。目前，国内广泛使用的gE-ELISA鉴别诊断试剂盒依赖于小鼠杂交瘤技术生产的单克隆抗体。然而，杂交瘤细胞存在传代不稳定、易丢失抗体分泌能力、生产周期长、成本高等局限。因此，开发一种稳定、高效且易于规模化生产的抗体形式成为行业技术升级的明确方向。

二、技术路径：从杂交瘤到单链抗体的工程化改造
本研究遵循一条清晰的技术路线：首先利用原核表达系统制备PRV gE重组蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠；通过细胞融合技术获得能稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株（命名为7B7）；进而采用分子生物学手段，从该细胞株中克隆抗体轻链（VL）和重链（VH）的可变区基因序列。

单链抗体的核心设计：单链抗体是基因工程抗体的一种重要形式。scFv是通过一段人工设计的柔性连接肽（Linker，常用(Gly₄Ser)₃）将VH和VL串联而成的单一多肽链。其最大优势在于保留了完整抗体的抗原结合特异性，同时摒弃了Fc片段，从而分子量更小（约25-30 kDa）、免疫原性更低、组织穿透力更强。更重要的是，scFv基因结构简单，易于通过原核表达系统（如大肠杆菌）进行高效、低成本的重组表达，完美规避了杂交瘤技术的弊端。

三、关键步骤与实验结果深度解读

基因克隆与序列分析：研究团队采用简并引物扩增出VH（约330 bp）和VL（约345 bp）基因。通过NCBI的IMGT数据库进行比对分析，证实所得序列为功能性重排序列，与已知的小鼠抗体胚系基因同源性极高（VH达97.64%，VL达98.30%），且具有完整的互补决定区结构，从序列层面保证了其潜在活性。
原核表达与蛋白鉴定：将密码子优化后的scFv基因克隆至pET-28a表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE和Western Blot结果显示，成功表达出约40 kDa的融合蛋白（含His标签）。值得注意的是，表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在，这与许多在大肠杆菌中表达的真核来源蛋白，尤其是含有二硫键的抗体片段所面临的常见挑战一致。相关研究（如Sandomonico et al., Int J Mol Sci, 2020）指出，大肠杆菌胞质的还原环境不利于二硫键的正确形成，可能导致蛋白错误折叠并形成聚集体。
结合活性验证：尽管以包涵体形式表达，但该scFv在变性复性后仍表现出优异的生物学活性。ELISA实验证实，它能特异性识别纯化的gE蛋白以及完整的PRV病毒粒子，且结合信号呈现明显的剂量依赖性。间接免疫荧光实验进一步直观显示，该scFv能特异性结合感染PRV的PK-15细胞，而与未感染细胞无交叉反应，有力证明了其用于免疫学检测的可行性。

四、技术难点与优化方向探讨
本研究成功制备了有活性的抗PRV gE scFv，但包涵体表达方式通常意味着后续需要复杂的变性复性步骤，且复性效率直接影响活性蛋白得率。针对这一普遍性技术难点，学术社区已有多种优化策略：

表达系统优化：如选用细胞质为氧化型的工程菌株（如SHuffle®系列），其能促进二硫键的正确配对，可显著提高scFv的可溶性表达比例。
融合标签策略：已有文献（Wang et al., Nat Commun, 2022）报道，某些短肽标签（如NT11*）能增强scFv在大肠杆菌中的可溶性和稳定性。
表达条件筛选：降低诱导温度（如16-25℃）、优化IPTG浓度和诱导时间，有助于减缓蛋白合成速度，促进正确折叠。

五、行业应用前景展望
基于该scFv的开发，可为PRV诊断带来多重价值：

鉴别诊断试剂升级：gE蛋白是缺失疫苗的标志性蛋白。针对gE的scFv可作为核心原料，开发新一代ELISA或胶体金试纸条，用于精准区分疫苗免疫动物与野毒感染动物，这是实现猪场净化至关重要的一环。
检测方法创新：scFv易于与报告酶（如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶）进行基因融合，构建“单组分”重组免疫试剂。这种融合蛋白可直接用于检测，无需二抗孵育步骤，简化操作流程，缩短检测时间，更适用于现场快速诊断。
成本与规模化优势：大肠杆菌发酵生产scFv的成本远低于动物体内制备单克隆抗体，且工艺稳定、周期短、易于质量控制，有利于诊断试剂的大规模生产和普及。

结论
综上所述，该项研究不仅成功制备了具有高特异性和反应活性的抗PRV gE单链抗体，更展示了一条从传统单抗技术向基因工程抗体升级的清晰技术路径。尽管在可溶性表达等方面仍有优化空间，但其成果已为开发更高效、经济、便捷的PRV特异性诊断工具奠定了坚实的物质基础。随着蛋白质工程和表达技术的不断进步，scFv等重组抗体形式必将在动物疫病监测、食品安全检测乃至生物医药研发等领域发挥越来越重要的作用。