基于CRISPR/Cas9构建chGSDME敲除株：解析禽类细胞焦亡的关键执行者

本文深入解读中国农业大学在《中国兽医杂志》发表的最新研究，团队利用CRISPR/Cas9技术成功构建chGSDME基因敲除DF-1细胞模型，通过多组实验证据揭示该基因在病毒诱导禽类细胞焦亡中的核心功能，为家禽免疫机制研究提供重要技术平台。

引言：禽类细胞焦亡研究的瓶颈与突破

细胞焦亡（Pyroptosis）是一种Gasdermin家族蛋白介导的程序性死亡方式，在宿主抗病毒免疫中发挥关键作用。根据PubMed收录的多篇研究显示，与哺乳动物不同，家禽基因组中缺乏关键的焦亡执行蛋白GSDMD。这一进化差异使得禽类细胞焦亡的执行机制成为领域内的重要科学问题。

中国农业大学研究团队的最新工作聚焦于禽类Gasdermin E（chGSDME），通过精确的基因编辑技术揭示了其在病毒诱导细胞焦亡中的重要作用，该研究成果为理解家禽免疫应答机制提供了新的视角。

研究背景：从基因序列到功能假设

通过NCBI Gene数据库查询可知，chGSDME（Gene ID: 420623）位于鸡的3号染色体，编码含有478个氨基酸的蛋白。与哺乳动物GSDME类似，其结构包含N端孔道形成域和C端抑制域。万方和知网的相关文献表明，该基因在禽类多种组织中均有表达，但其在免疫应答中的具体功能尚不明确。

研究团队基于生物信息学分析提出科学假设：chGSDME可能补偿了禽类缺失GSDMD的功能，在病毒感染的细胞焦亡中扮演关键角色。验证这一假设的前提是获得稳定可靠的基因敲除细胞模型。

实验设计：CRISPR/Cas9系统的精准应用

1. sgRNA设计与载体构建
研究团队从NCBI获取chGSDME基因完整序列，利用CRISPOR在线工具（参考文献来源：Nucleic Acids Research）针对第一外显子设计了两条特异性sgRNA。通过BbsI酶切将寡核苷酸片段克隆至PX459载体（Addgene #48139），构建重组敲除质粒。

2. 细胞转染与单克隆筛选
将重组质粒通过jetPRIME转染试剂导入DF-1细胞，48小时后使用10μg/mL嘌呤霉素进行压力筛选。通过有限稀释法获得单细胞克隆，扩大培养后用于后续鉴定。

3. 多重验证确保敲除效果

• Western Blot验证：使用实验室自制chGSDME抗体检测蛋白表达，GAPDH作为内参

• 基因测序分析：针对靶点区域进行PCR扩增和TA克隆测序，确认基因编辑效率

结果与分析：从表型到机制的深入探索

1. 成功构建敲除细胞株
基因测序结果显示，DF-1-ΔchGSDME细胞在靶位点发生移码突变，Western Blot证实chGSDME蛋白完全缺失。细胞形态学观察显示，敲除细胞与野生型在正常培养条件下无显著差异。

2. 细胞活性不受影响
CCK-8法检测显示，在12-48小时培养期间，两组细胞活性无统计学差异（P>0.05），表明chGSDME缺失不影响细胞基础增殖功能。

3. 病毒诱导焦亡显著抑制
用ARV、IBDV和VSV分别感染细胞后观察到：

• 野生型细胞出现典型焦亡形态（气泡样肿胀）

• 敲除细胞焦亡表型明显减轻

• LDH释放检测显示敲除细胞上清液中LDH含量显著降低（P<0.01或P<0.05）

讨论与展望：技术平台的价值与应用前景

本研究通过严谨的实验设计，不仅成功构建了chGSDME基因敲除细胞模型，更重要的是明确了其在病毒诱导细胞焦亡中的执行功能。这一发现与Zhou等人在Nature Cell Biology上发表的“全长GSDME介导焦亡”的新机制形成了有趣对话。

从技术层面看，该研究展示了CRISPR/Cas9系统在禽类细胞基因编辑中的高效性，为禽类功能基因组学研究提供了可靠方法。从应用角度，DF-1-ΔchGSDME细胞株可作为重要研究工具，用于：

1. 筛选调控chGSDME活性的宿主因子

2. 研究不同病毒逃逸宿主免疫的机制

3. 开发针对家禽病毒性疾病的干预策略

结语

这项研究通过精准的基因编辑技术，成功解析了chGSDME在禽类细胞焦亡中的关键作用，填补了禽类免疫机制研究的空白。随着对Gasdermin家族蛋白认识的深入，相信会有更多禽类免疫应答的奥秘被揭开，为家禽健康养殖和疾病防控提供理论基础。

参考文献

1. 原始研究论文：中国兽医杂志.2025;61(11):35-40

2. Gasdermin蛋白综述：Nat Rev Immunol. 2020;20(3):143-157

3. CRISPR/Cas9技术：Nucleic Acids Res. 2016;44(W1):W272-276

4. GSDME功能研究：Nature. 2017;547(7661):99-103