我们如何利用单B细胞筛选技术，高效捕获PRRSV高效价抗体？

原创于 2025-09-25 08:00:00 发布 · 669 阅读

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在动物疫病防控领域，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）因其变异快、免疫抑制强，一直是困扰养猪业的“顽疾”。传统的疫苗和诊断方法常常落后于病毒的变异速度，因此，开发能够精准识别病毒保守区域的高质量抗体，就显得至关重要。

今天，我们就来深入聊聊一项在我们最新研究中大放异彩的技术——单B细胞筛选，看它如何突破传统瓶颈，成为制备PRRSV N蛋白单克隆抗体的“利器”。

在动手之前，策略选择是成功的基石。我们选择了PRRSV的核衣壳蛋白（N蛋白）作为靶点，原因有二：第一，它是病毒中保守性最高的蛋白之一，针对它开发的抗体不易因病毒变异而失效；第二，它在病毒感染早期大量表达，是理想诊断标志物。

而在技术路径上，我们放弃了传统的杂交瘤技术。虽然杂交瘤技术很经典，但其周期漫长（往往需要3-6个月），且通量低，效率不佳。我们也评估了噬菌体展示技术，但它存在一个固有缺陷：抗体的重链和轻链是随机组合的，容易产生“拉郎配”，导致得到的抗体亲和力不高或特异性不强。

因此，我们选择了单B细胞筛选技术。它的核心优势在于：能够直接从免疫动物体内分离出单个抗原特异性的B细胞，这个细胞天然产生的抗体，其重链和轻链就是完美配对的。这相当于直接从“精锐部队”中挑选“神枪手”，保证了抗体的高质量。

我们的工作流程可以概括为以下几个关键步骤：

精准“造靶”： 首先，我们通过基因工程手段，成功构建了pET28a(+)-sumo-N重组质粒，并利用原核表达系统获得了高纯度、可溶性的N蛋白。这一步是为后续免疫和筛选提供高质量的“诱饵”。
高效“筛选”： 用纯化的N蛋白免疫BALB/c小鼠后，我们采用了Hypercell高通量单细胞筛选平台。这个平台的厉害之处在于，它一次可以快速筛选数十万个细胞，并且整个过程是可视化的，极大地提高了筛选效率，并避免了细胞污染。
智能“分析”： 获得分泌抗体的阳性B细胞后，我们对其进行单细胞测序，获取抗体基因序列。随后，利用AbFinder生物信息学平台对这些序列进行综合评分（包括基因亚型、重链完整性等），智能筛选出最优的轻链和重链基因。这个过程快速而精准，分析3000条序列仅需约1小时。
快速“量产”： 将筛选出的优质抗体基因构建成真核表达质粒，瞬时转染CHO细胞进行表达。这种方式无需建立稳定的细胞株，大大缩短了抗体生产周期，仅用一周左右即可获得可用于实验的抗体。

通过上述技术路线，我们成功获得了5株靶向PRRSV N蛋白的单克隆抗体，并将其命名为253、295、365、570和820。性能验证结果令人振奋：

高效价： 所有抗体效价均高于1:100,000，其中570和820号抗体的效价更是达到了1:409,600。高效价意味着在实际检测中，抗体可以被高度稀释仍能有效工作，显著降低了检测成本。
高特异性： Western Blot实验证实，这5株抗体均只与PRRSV的N蛋白结合，与病毒的其他蛋白（如M蛋白）无任何交叉反应，有效避免了假阳性的发生。
高亲和力： 通过生物膜干涉技术（BLI）测定，这些抗体的亲和力极高，解离常数（Kd）最低达到了1.00×10⁻¹² mol/L（570号抗体），属于皮摩尔级别的超高亲和力。高亲和力抗体与抗原结合更牢固，能显著提升检测方法的灵敏度。
识别不同表位： 表位分组实验表明，这5株抗体结合在N蛋白的不同位点上，宛如“五虎将”各守一方。这一特性非常重要，意味着它们有潜力被组合使用，开发出灵敏度更高、检测范围更广的“抗体对”用于诊断试剂盒。