技术详解：抗periostin人源化单抗的制备与鉴定全流程

在生物制药领域，抗体人源化是一个复杂而精细的过程。本文将详细解析抗periostin人源化单克隆抗体的制备流程，从基因克隆到功能验证，为相关领域的研究人员提供技术参考。

一、基因克隆与序列分析
研究首先从鼠源杂交瘤细胞中提取总RNA，通过RT-PCR扩增VH和VL基因。扩增条件为：94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。1%琼脂糖凝胶电泳显示VH和VL区大小均为400 bp，与预期一致。

测序分析获得轻重链可变区氨基酸序列。轻链可变区序列为：DIVLTQSPAIMSASPGDKVTMTCSASSSASYMHWYQQKSGTSPKRWYDTSKLASCVPARFSGSGGTSYSLTISMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK；重链可变区序列为：EVQLQQSGPELYKPGASVRISKKASGYSTTDYFMNWVKQSHGRSLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGATTLTVDRSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRSCVSGLDYWCQGTSVTVSS。

二、载体构建与优化
采用overlapping PCR技术将人源化抗体VH与人抗体恒定区直接拼接。在VH基因的5'端加入HindⅢ酶切位点，3'端加入EcoRⅠ酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后克隆到pGEM-T载体中，获得pGEMT-VH-CH。

用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pGEMT-VH-CH载体，将VH-CH片段克隆至pcDNA3.4中，获得pcDNA3.4-VH-CH。同样方法构建轻链表达载体pcDNA3.4-VL-CL。最后将人源化抗体重链和轻链亚克隆到表达载体pATX-GS2中，构建pATX-GS2-VH-VL。

三、细胞转染与筛选
用PvuⅠ线性化质粒pATX-GS2-VH-VL，37℃酶切1-2小时。通过电转染将线性化质粒导入CHO-K1细胞，采用FectoCHO™表达系统转染试剂盒。

转染48小时后，用30 μmol/L MSX进行加压筛选。每3-4天更换筛选培养基，2-3周后获得3个稳定转染的CHO-K1细胞池。通过有限稀释法筛选单克隆细胞株，稀释细胞悬液至每孔1个细胞，最终获得7个阳性单克隆细胞株。

四、表达与纯化
在125 mL摇瓶中进行培养，采用分批补料策略。在第3、5、7、9天添加补料培养基，连续培养至细胞活力下降至50%以下。收集培养上清，采用Protein A亲和层析进行纯化。

SDS-PAGE分析显示，纯化后的抗体在还原条件下呈现25 kDa轻链和50 kDa重链条带，非还原条件下完整抗体约为150 kDa，纯度达95%以上。

五、功能验证
Western blot分析证实抗体能与periostin特异性结合。血管形成实验显示，该抗体能显著抑制periostin诱导的HUVEC细胞血管生成，且具有浓度依赖性。当抗体浓度达到100 μg/mL时，抑制率超过80%。

这项研究建立了完整的抗体人源化技术平台，为治疗性抗体的开发提供了重要参考。特别是在纤维化疾病治疗领域，展现出良好的应用前景。