易基因：RRBS及EWAS分析揭示同卵双生子与肾小球滤过率相关的DNA甲基化位点｜疾病研究

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慢性肾脏病（Chronic kidney disease，CKD）以肾功能持续下降为特征，其主要评估指标为估算肾小球滤过率（eGFR）。eGFR的下降不仅预示着CKD的发生，还与心血管疾病风险密切相关。既往研究表明，eGFR具有一定的遗传性，但全基因组关联研究（GWAS）仅能解释部分eGFR变异，但提示表观遗传学因素可能在eGFR调控中发挥重要作用。DNA甲基化（DNAm）是最常见的表观遗传修饰之一，已有研究发现其与eGFR相关，但在中国人中的研究较少。

近日，青岛大学公共卫生学院张东峰教授团队通过简化基因组重亚硫酸盐测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS）和表观基因组关联研究（EWAS），分析了中国同卵双生子的DNA甲基化图谱，寻找与估算eGFR相关的甲基化位点和区域，并探讨了其因果关系。研究发现多个与eGFR显著相关的CpG位点和差异甲基化区域（DMRs），并验证了SYNGR3基因的甲基化水平与低eGFR水平的关联。相关研究成果以“Epigenome-wide association study of Chinese monozygotic twins identifies DNA methylation loci associated with estimated glomerular filtration rate”为题发表于《Journal of Translational Medicine》期刊。

本研究开展了一项表观基因组关联研究，旨在探讨中国同卵双生子中DNAm与eGFR之间的关联。研究采用RRBS检测了全基因组范围内的DNAm水平。利用广义估计方程（GEE）分析CpGs中DNAm与eGFR之间的关联。通过家族混杂因素检验因果关系的方法（ICE FALCON）推断因果关系。采用comb-p方法鉴定差异甲基化区域（DMRs）。利用GeneMANIA分析基因相互作用网络，并通过基因组区域注释富集工具（GREAT）富集生物学功能和通路。通过基因表达谱测序检测mRNA表达水平，并利用GEE模型探究基因表达与eGFR之间的关联。通过计算甲基化风险评分（MRS），在社区人群中验证候选基因。

研究结果共鉴定出80个CpGs和28个DMRs达到全基因组显著性水平，这些CpGs和DMRs位于OLIG2、SYNGR3、LONP1、CDCP1和SHANK1等基因中。12个位于SYNGR3和C9orf3等基因的CpGs支持DNAm对eGFR的因果效应，而13个位于EPHB3和MLLT1等基因的CpGs证明了eGFR对DNAm的因果效应。富集分析揭示了与eGFR相关的多个重要生物学功能和通路，包括α-2A肾上腺素受体结合通路和促肾上腺皮质激素释放激素受体活性通路。GeneMANIA结果显示，SYNGR3与MLLT1共表达，并与AFF4和EDIL3存在遗传互作。基因表达分析发现SYNGR3表达水平与eGFR呈负相关。验证分析表明，SYNGR3的MRS与低eGFR水平呈正相关。

本研究结果鉴定出一系列可能与eGFR相关的CpGs、DMRs和通路，尤其是在SYNGR3基因中。这些发现为理解eGFR下降和慢性肾脏病相关的表观遗传修饰提供了新的见解。

研究方法

样本选择：研究纳入了2012至2013年间在青岛招募的244对同卵双生子，最终筛选出61对eGFR存在差异的双生子进行分析。

DNA甲基化检测：采用RRBS技术检测全基因组范围内的DNA甲基化水平。RRBS结合限制性酶切和亚硫酸盐处理，能够高效分析CpG岛区域的甲基化模式。

统计分析：鉴定差异甲基化区域（DMRs），评估CpG位点甲基化水平与eGFR的关系，推断DNAm与eGFR之间的因果关系。分析基因相互作用网络，基因组区域富集分析。对部分基因进行基因表达分析，验证其与eGFR的相关性。

验证研究：在社区人群中对SYNGR3基因的甲基化水平进行定量分析，并计算甲基化风险评分（MRS），评估其与低eGFR水平的关联。

结果图形

（1）表观基因组范围关联分析（EWAS）

图1：eGFR的EWAS曼哈顿图。横坐标为染色体数，纵坐标为-log10转换后的P值。黑色实线表示显著性阈值，显著性位点用红点表示。

表1：eGFR的EWAS结果（前20）

（2）因果关系分析

12个CpG位点（如SYNGR3和C9orf3）显示出DNAm对eGFR的因果效应；13个CpG位点（如EPHB3和MLLT1）显示出eGFR对DNAm的因果效应。

表2：eGFR的因果推理分析结果

（3）差异甲基化区域（DMR）分析

共发现80个CpG位点和28个DMRs与eGFR达到全基因组显著性水平（FDR < 0.05）。这些位点和区域涉及多个基因，如OLIG2、SYNGR3、LONP1、CDCP1和SHANK1等。

表3：显著差异甲基化区域（DMR）结果

图2：所鉴定的DMRs不同甲基化模式图。Y轴表示每个CpG位点与估算eGFR的相关系数，X轴表示染色体位置。黑色点代表每个CpG位点，蓝色线条表示每个DMR的甲基化模式。BP表示碱基对，chr表示染色体。

（3）基因互作网络分析和富集分析

GeneMANIA结果显示SYNGR3与MLLT1共表达，并与AFF4和EDIL3存在基因相互作用。GREAT分析揭示了与eGFR相关的多个重要生物学功能和通路，如α-2A肾上腺素受体结合通路、促肾上腺皮质激素释放激素受体活性通路等。

图3：基因互作网络示意图。紫色表示共表达；红色表示物理相互作用；绿色表示基因相互作用；黄色表示预测关系。

表4：可能与eGFR相关区域的GREAT GO富集分析

易小结

本研究通过RRBS及EWAS分析在同卵双生子中鉴定了与eGFR相关的多个CpG位点、DMRs和生物学通路，尤其是SYNGR3基因。研究结果可能为进一步研究eGFR下降慢性肾脏病相关的的表观遗传修饰提供重要线索，并有助于发现CKD的新诊断标志物和治疗靶点。

RRBS在本研究中的重要作用

• 高效检测CpG岛甲基化：RRBS技术专注于CpG岛等富含CpG的区域，这些区域在基因调控中起关键作用。通过RRBS，研究能够高效、经济地分析这些区域的甲基化模式，从而识别与eGFR相关的潜在调控位点。
• 精确分析甲基化水平：RRBS通过亚硫酸盐测序，能够精确测量单个CpG位点的甲基化水平。这种高分辨率的检测方法使得研究人员能够准确评估甲基化水平与eGFR之间的关联。
• 支持全基因组关联分析：RRBS生成的甲基化数据为全基因组关联研究（EWAS）提供了基础。通过分析大量CpG位点的甲基化状态，研究能够识别出在全基因组范围内与eGFR显著相关的位点和区域。
• 揭示表观遗传变异：RRBS有助于揭示个体间在DNA序列相同的前提下的表观遗传变异。在同卵双生子中，这种变异可能主要由环境因素引起，从而为研究eGFR的环境调控机制提供了重要线索。

关于易基因简化基因组甲基化测序（RRBS）研究解决方案

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。

为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。

技术优势：

• 起始量：100ng gDNA；
• 单碱基分辨率；
• 多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；
• 针对性强，成本较低；
• 基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

• 队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选
• 复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究
• 模式动物发育和疾病甲基化研究

技术参数	RRBS	DRRBS	cfDNA-RBS	Micro-RBS	sc-RBS
原理	MspI酶切+连接接头	多酶切+连接接头	CCGG邻近片段连接接头	CCGG邻近片段连接接头	CCGG邻近片段连接接头
样本要求	1μg	1μg	1ng	1ng	单细胞/1-10个细胞
测序数据量	10G	15G	20G	20G	2G
5XCG位点覆盖	6M	8M	6M	10M	4-8M

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Qi X, Wang J, Wang T, Wang W, Zhang D. Epigenome-wide association study of Chinese monozygotic twins identifies DNA methylation loci associated with estimated glomerular filtration rate. J Transl Med. 2025 Jan 22;23(1):101. pii: 10.1186/s12967-025-06067-4. doi: 10.1186/s12967-025-06067-4.

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