【文献速递】USP30-APEX2邻近-泛素组学精确锁定USP30的底物蛋白

研究背景

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，参与调控蛋白质稳定性、信号转导、细胞周期等多种生命过程。去泛素化酶（DUBs）负责移除蛋白质上的泛素链，与泛素化过程共同维持细胞内蛋白质稳态。DUBs的异常活性与多种疾病（如癌症、神经退行性疾病）密切相关，因此成为潜在的治疗靶点。USP30是一种定位于线粒体外膜（OMM）的DUB，已被证实参与调控线粒体自噬（mitophagy）。USP30通过去除线粒体蛋白上的泛素链，抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬过程。

图1 实验原理图（Damianou et al., 2025）。

Oxford大学Kessler团队开发了一种整合“APEX2邻近标记”与“K-ε-GG泛素化富集”的新方法（proximal-ubiquitomics），并以USP30为模型，验证其在线粒体自噬过程中的底物识别能力。传统泛素组学（K-ε-GG IP）测的是全细胞所有泛素化事件，分不清哪些泛素化是USP30直接调控的。加上APEX2邻近标记后，只关注USP30周围20 nm以内的泛素化事件，极大压缩背景。

实验方法

①把USP30邻近的所有蛋白的快速生物素化，加生物素-苯酚（biotin-phenol）并H₂O₂触发APEX2催化功能，1 min内产生自由基，把生物素共价连接到邻近蛋白的酪氨酸上；

②细胞裂解，用链霉亲和素珠子（Streptavidin beads）来富集生物素化的蛋白；

③把富集到的蛋白先酶切成肽段，再用抗体富集含“K-ε-GG”泛素残基的肽，最后进行质谱鉴定。

图2 USP30-APEX2邻近-泛素组学实验流程（Damianou et al., 2025）。

实验结果

图B为内源vs APEX2-USP30的表达量检测：融合酶条带清晰，表达量≈ 3.8倍内源水平，无过量表达导致的错误定位风险；

图C为HA-Ub-PA活性探针检测USP30酶活性，结果表明融合酶被探针共价捕获分子量↑，证明USP30的催化中心仍具活性；

图D为免疫荧光共定位，生物素信号（APEX2标记）与线粒体膜蛋白TOMM20完全重叠，融合酶仍在正确位置。

图3 USP30-APEX2 邻近-泛素组学实验的可靠性验证结果（Damianou et al., 2025）。

“邻近+泛素”双重过滤，让线粒体外膜泛素化蛋白的富集效率提升2倍，背景噪音大幅下降。

①总蛋白中，线粒体外膜蛋白OMM比例最低约10%——符合预期，全细胞蛋白里线粒体外膜只是小部分。

②在全细胞泛素化蛋白中，OMM比例稍有上升，但仍<15%，说明传统K-ε-GG富集对OMM没有明显偏好。

③邻近+泛素化蛋白中，OMM占比翻倍到近30%！，说明经过APEX2-USP30导航后，泛素化事件被定向浓缩在线粒体外膜；背景蛋白大量剔除，真正与USP30空间相邻的泛素化底物显著突出。

图4 “邻近+泛素”高效富集线粒体外膜的泛素化蛋白（Damianou et al., 2025）。

参考文献

Damianou A, Jones H B L, Grigoriou A, et al. Integrative proximal-ubiquitomics profiling for deubiquitinase substrate discovery applied to USP30[J]. Cell Chemical Biology, 2025, 32(5): 736-751. e8.