如何使用Picard和SAMtools对ChIP-seq数据进行质量控制

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已于 2024-08-27 13:45:06 修改

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文章标签： linux

于 2024-08-27 11:27:41 首次发布

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ChIP-seq实验通常需要使用大量的起始细胞（通常是几百万个细胞）来确保足够的DNA量进行免疫共沉淀和后续测序。这会导致最终生成的数据量较大，数据的复杂性和冗余性也会增加。通过过滤这些类别的reads，ChIP-seq分析可以显著减少噪声，因此，对生成的BAM文件进行过滤是非常必要的，以提高数据的质量和分析的准确性。

1.Duplicates（重复reads）
定义：重复reads通常是由PCR扩增过程产生的相同的DNA片段的多次测序结果。这些reads并不代表新的生物学信息，因此会被视为冗余数据。
过滤方法：可以使用工具如`Picard`的`MarkDuplicates`或`SAMtools`的`rmdup`来标记和去除这些重复reads。

2.低质量reads
定义：低质量reads指的是比对质量得分较低的reads，通常这些reads可能是错误比对或不可靠的比对结果。
过滤方法：常用的过滤标准是比对质量（MAPQ）值，通常设置阈值，如`MAPQ>30`，来过滤掉比对质量较差的reads。可以使用`SAMtools`或`alignmentSieve`进行这项操作。

3.未比对上的reads
定义：这些reads在比对过程中没有成功比对到参考基因组上，因此不包含有用的位置信息。
过滤方法：未比对的reads通常会在比对工具输出BAM文件时自动排除。如果存在未比对的reads，可以通过`SAMtools`的`-F4`标志进行过滤。

4.Supplementaryalignments（补充比对）
定义：补充比对是指当一个reads在基因组上有多个比对位置时，除了主要比对位置外的其他比对位置。通常用于表示跨越结构变异或在不同染色体之间的比对。
过滤方法：这些比对有时会增加数据复杂性，因此在ChIP-seq分析中，通常会通过`SAMtools`的`-F2048`标志来过滤掉这些补充比对reads。

5.比对到黑名单区域的reads
定义：黑名单区域是基因组中已知的非特异性富集区域，这些区域通常包含高背景信号或容易导致假阳性的reads。ENCODE项目等提供了常见的黑名单区域列表。
过滤方法：可以使用`bedtools`或`alignmentSieve`等工具，将比对到这些黑名单区域的reads过滤掉。

6.未正确成对比对的reads（对于PE数据）
定义：对于双端测序（PE），有时一对reads中只有一个reads成功比对，或者两端reads比对位置不符合正常范围，这些reads通常被视为异常或不可靠。
过滤方法：使用`SAMtools`的`-f2`标志过滤出成功成对比对的reads。

7.次优比对reads
定义：次优比对（secondaryalignments）是指在reads有多个比对位置时，次优位点的比对。尽管这些reads与参考基因组比对，但它们的位置信息可能不准确。
过滤方法：这些reads通常通过`SAMtools`的`-F256`标志进行过滤。

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一般方法

在ChIP-seq数据分析中，数据的质量控制是非常重要的一环。为了确保数据的高质量，我们通常需要标记和去除重复reads、过滤低质量比对的reads、去除未比对的reads、补充比对（supplementary alignment）、以及比对到黑名单区域的reads。

### 1. 使用Picard标记重复reads

**重复reads**（duplicate reads）是指在PCR扩增过程中，由于相同的DNA片段被多次扩增，从而在测序数据中出现多个相同的reads。这些重复reads会增加数据的冗余性，并可能导致假阳性结果。因此，首先需要标记这些重复reads。

我们使用`Picard`工具中的`MarkDuplicates`功能来标记这些重复reads。
# 使用 Picard 标记 duplicates

java -jar picard.jar MarkDuplicates \
    I=input.bam \
    O=marked_duplicates.bam \
    M=marked_dup_metrics.txt \
    REMOVE_DUPLICATES=false \
    CREATE_INDEX=true

- **I=input.bam**：输入BAM文件。
- **O=marked_duplicates.bam**：输出标记了重复reads的BAM文件。
- **M=marked_dup_metrics.txt**：输出重复reads的统计信息。
- **REMOVE_DUPLICATES=false**：设置为`false`表示只标记重复reads而不删除它们。
- **CREATE_INDEX=true**：生成BAM文件的索引。

这一步会生成一个标记了重复reads的BAM文件（`marked_duplicates.bam`）和一个重复reads的统计文件（`marked_dup_metrics.txt`）。标记后的重复reads将在后续分析中被过滤掉。

### 2. 使用SAMtools去除低质量比对的reads

标记了重复reads后，我们需要进一步使用`SAMtools`对BAM文件进行过滤。这里我们将去除以下几类低质量比对的reads：
- 低比对质量的reads（MAPQ < 30）
- 未比对上的reads
- 次优比对的reads（secondary alignments）
- 补充比对的reads（supplementary alignments）
- 被标记为重复的reads
# 使用 SAMtools 去除各种低质量比对

samtools view -b \
    -q 30 \                 # 去除比对质量 (MAPQ) 小于30的reads
    -F 4 \                  # 去除未比对的reads
    -F 256 \                # 去除次优比对的reads (secondary alignments)
    -F 1024 \               # 去除标记为PCR duplicates的reads
    -F 2048 \               # 去除补充比对的reads (supplementary alignments)
    marked_duplicates.bam > filtered.bam

- **-q 30**：只保留比对质量（MAPQ）大于等于30的reads。
- **-F 4**：去除未比对上的reads。
- **-F 256**：去除次优比对的reads。
- **-F 1024**：去除标记为重复的reads（这一步过滤的是被Picard标记为重复的reads）。
- **-F 2048**：去除补充比对的reads。

这一步将生成一个经过严格过滤的BAM文件（`filtered.bam`），其中包含了高质量的比对reads。

### 3. 使用bedtools去除比对到黑名单区域的reads

基因组黑名单区域是已知的噪声区域，在这些区域内的reads通常是不可靠的，容易产生假阳性结果。因此，我们需要去除比对到这些黑名单区域的reads。

假设你有一个黑名单文件`blacklist.bed`，可以使用`bedtools`来去除比对到这些区域的reads：
# 使用 bedtools 去除比对到黑名单区域的reads

bedtools intersect -v \
    -a filtered.bam \     # 输入经过过滤的BAM文件
    -b blacklist.bed \     # 黑名单区域的BED文件
    > final_filtered.bam

- **-v**：只保留不与黑名单区域相交的reads。
- **-a filtered.bam**：输入经过前一步过滤的BAM文件。
- **-b blacklist.bed**：黑名单区域的BED文件。

这一步会生成一个最终过滤后的BAM文件（`final_filtered.bam`），其中去除了所有比对到黑名单区域的reads。

### 4. 生成索引

为了方便后续分析，我们需要为最终过滤后的BAM文件生成索引。
# 为最终BAM文件生成索引

samtools index final_filtered.bam

通过这个索引文件，我们可以快速访问BAM文件中的特定区域，进一步提高数据分析的效率。

### 总结

通过本文介绍的方法，我们可以使用`Picard`和`SAMtools`对ChIP-seq数据进行全面的质量控制。首先，使用`Picard`标记重复reads，然后使用`SAMtools`过滤低质量比对的reads，最后使用`bedtools`去除比对到黑名单区域的reads。经过这些步骤后，得到的BAM文件将具有更高的质量，更适合下游的生物学分析。

希望这篇文章能对你的ChIP-seq数据分析有所帮助！如果有任何问题或建议，欢迎在评论区讨论

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以下是总结涉及到的主要知识点：

2.数据处理与质量控制

*测序数据的格式：熟悉FASTQ、BAM、SAM等常用的生物信息学数据格式，以及这些格式中的关键信息（如测序质量分数、比对位置等）。

*比对质量控制：理解比对质量得分（MAPQ）的意义，为什么需要过滤低质量的比对reads，以及如何使用工具（如SAMtools）进行这类操作。

*重复reads的识别与去除：了解PCR扩增产生重复reads的原因，为什么去除这些重复reads可以提高数据的信噪比。

*数据的冗余与噪声处理：了解如何通过过滤未比对reads、补充比对、次优比对、黑名单区域等，减少数据冗余和噪声。

3.生物信息学工具的使用

常用工具：

SAMtools：用于处理和过滤BAM/SAM文件，如去除未比对reads、低质量比对reads、重复reads等。

Picard：用于标记和去除PCR重复reads。